BAB I PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Kromatografi
adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara
fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa
zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu
kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian
kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai
oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah
kolom
Kromatografi
merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu
lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan
cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner
mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu
cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi
menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan
teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi cairan
kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan
dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena
gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan
waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam
teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya
sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan
sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan
kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju
alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan
metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada
dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di
pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia
organik
1.
Pengertian
HPLC
2.
Jenis-
jenis HPLC
3.
Instrument
HPLC
4.
Prinsip
kerja HPLC
5.
Aplikasi
HPLC
6.
Manfaat
Penggunaan HPLC
7.
Kelebihan
dan Kekurangan HPLC
a.
Mengetahui Pengertian HPLC
b. Mengetahui Jenis- jenis
HPLC
c. Mengetahui Instrument HPLC
d. Mengetahui Prinsip kerja HPLC
e. Mengetahui Aplikasi HPLC
f. Mengetahui Manfaat Penggunaan HPLC
g. Mengetahui Kelebihan dan Kekurangan HPLC
BAB II PEMBAHASAN
2.1. Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau
biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif dan kuantitatif. HPLC
secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi
kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh
gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai
dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan komponen sampel lebih
cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam berbagai
bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri
makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem
HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein,
analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral.
2.2
Jenis- Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal
dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui
sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan
kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase
diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini
memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika
mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2.
Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah
silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang
digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar
seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang
paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau
asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat
asam lemah atau basa lemah, peranan pH
sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami
ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan
ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam
bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi
akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat
menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang
beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah
polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan
menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan
pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi
penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total
atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase
gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan
untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat
pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi
permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa
dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa
silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus
(lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang
mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian
molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih
kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan
tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase
diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena
interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung
gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis
ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
kompleks.
2.3
Instrument HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat
untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung
buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram
skematik sistem kromatografi cair dapat
dilihat pada gambar di bawah ini :
2.3.1
Wadah fase gerak (Reservoir)
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada
fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga
akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi
dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase
normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat
dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam
kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.
v
Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga
eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran
campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan
solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah
satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
v Persyaratan fase gerak HPLC:
1. Zat cair harus bertindak sebagai
pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk
menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk
menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh,
murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya
kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.
v Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:
a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi
antara fase diam polar dan fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica,
alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan
fase
gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi
antara fase diam non-polar dan fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air,
methanol, atau asetinitril.
Fase gerak yang baik memberikan factor
kapasitas k’ pada rentang yang sesuai.
Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5
2.3.2
Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC
adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni:
pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa
adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang
digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Ø Tiga jenis pompa yang
digunakan dalam HPLC:
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari
ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston
mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak
langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat
dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup
saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke
dalam kolom.
b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai
syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan
oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung
pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut
didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa.
Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan
takanan balik kolom.
2.3.3
Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke
bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom.
Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau
manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel
loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).
Ø
Ada tiga tipe dasar injektor yang
dapat digunakan :
a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi
dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi.
Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi
tidak dipengaruhi
b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC
sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan
pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua
pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak
(akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya
digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan
cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil
dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop
pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam
kolom.
Ø
Syarat- syarat
injektor yang baik :
- Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam
bentuk sesempit mungkin
- Mudah digunakan
- Keberulangan tinggi
- Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
2.3.4
Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom
konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana
terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang
utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
Ø Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir
fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
Ø Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Ø Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal
sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak
setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
v
Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa
silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan
sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat
dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi
lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil
(nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika
yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.
2.3.5 Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan
menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai
karakteristik sebagai berikut:
a.
mempunyai respon terhadap solut
yang cepat dan reprodusibel;
b.
mempunyai sensitifitas yang
tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil;
c.
stabil dalam pengopersiannya;
d.
mempunyai sel volume yang kecil
sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
e.
signal yang dihasilkan
berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran
dinamis linier);
f.
tidak peka terhadap perubahan
suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Karakteristik detector HPLC:
Dasar
Pendeteksian
|
Jenis
|
Maksimum
sensitifitas
|
Peka terhadap
kecepatan alir
|
Sensitivitas
suhu
|
Absorbsi UV
|
Spesifik
|
2 x 10-16
|
Tidak
|
Rendah
|
Absorbsi IR
|
Spesifik
|
10-6
|
Tidak
|
Rendah
|
Flourometri
|
Spesifik
|
10-11
|
Tidak
|
Rendah
|
Indek bias
|
Umum
|
1 x 10-7
|
Tidak
|
+ 10-4 0 C
|
Konduktometri
|
Spesifik
|
10-8
|
Ya
|
2% 0C
|
Spektometri massa
|
Umum
|
10-10
|
Tidak
|
Tidak ada
|
elektrokimia
|
Spesifik
|
10-12
|
Ya
|
1,5% 0C
|
2.4
Prinsip Kerja HPLC
Kerja
HPLC
pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,
alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah
pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit
akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke
detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum
yang puncak-puncaknya terpisah.
Urutan
skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton <
golongan alkohol < golongan asam.
HPLC dapat
menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang
paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT).
Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak
milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D
dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga
sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut
juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian
melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di
dalam sampel. Yang berperan dalam proses
separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa
jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa
carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang
khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat
(Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-,
polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan
jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah
komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan
konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan
preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC
sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah
karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya
melalui proses pelarutan saja.